Isolement et séparation des protéines sériques du lait de chamelle : mise en évidence du phénomène de désamidation de l'a-lactalbumine;conséquences sur la stabilité structurale

Abstract

Les protéines sériques du lait camelin collecté dans la région de Ouargla ont été fractionnées par chromatographie d’échange d’anions sur DEAE Cellulose et par perméation sur Sephacryl S200 et caractérisées par leurs comportements électrophorétiques sur gel de polyacrylamide dans diverses conditions. L’α-La cameline a été isolée par FPLC sur mono Q. Cette protéine migre en une seule bande en SDS-PAGE et en deux bandes en Alkaline-PAGE. La désamidation non enzymatique de l’α-la cameline été mise en évidence en suivant par FPLC sur mono Q son comportement quand elle est incubée dans un tampon phosphate de sodium, aux pH (7,4 et 8,4) pendant des temps variables (0-80 h) à 37°C. Contrairement à l’α- La du lait bovin, celle provenant du lait de dromadaire, reste instable dans les conditions physiologiques à 37°C, à pH neutre (7,4) ou à pH plus basique (8,4). Nous avons montré que cette transformation chimique est séquencée avec apparition de deux nouvelles isoformes : A2 (qui apparait rapidement aux pH 7,4 et 8,4) et A3 (qui n’apparait que lentement à pH 8,4). Ce résultat est confirmé par l’étude de la modélisation moléculaire de cette protéine. Les trois isoformes de l’α-La cameline A1, A2 et A3, purifiées en deux étapes, par FPLC puis par HPLC, ont été caractérisées par 2D-PAGE et leurs pHi apparents déterminés sont estimés à 5,63 (A1), 5,36 (A2) et 5,05 (A3). A l’aide de la spectroscopie (FT-ICR), les masses moléculaires suivantes ont été déterminées pour les trois isoformes : 14 421,8659 (A1), 14 422,8569 (A2) et 14 423,8479 Da (A3). L’analyse par spectrométrie de masse en tandem (FTICR- MS/MS) a permis de montrer qu’il s’agit bien des résidus Asn16 et Asn45 qui étaient sujets au phénomène de désamidation chimique. La désamidation non enzymatique de l’α-La cameline rend la structure tridimensionnelle beaucoup plus stable. Cette conclusion est rendue possible par les résultats des approches spectrométrique, thermodynamique et protéolytique développées.